Retour à l'accueil
Retour à l'accueil Comment nous contacter ?

Informations destinées aux professionnels de santé

Les prions Clinique et examens complémentaires Diagnostic Prise en charge Epidémiologie Prévention du risque iatrogène Documents à télécharger Adresses et liens utiles  

La PrP pathologique et la nature de l'agent haut

Le spectre d’inactivation très particulier des ATNC ainsi que la nature biochimique et structurale des plus petites fractions infectieuses purifiées ont conduit Stanley Prusiner à proposer l’hypothèse d’un agent transmissible de nature exclusivement protéique.(Prusiner, 1982)

Propriétés physico-chimiques des ATNC

 

Les ATNC possèdent des propriétés peu communes de résistance aux procédés habituels d'inactivation des agents microbiologiques. Les techniques conventionnelles de stérilisation ne permettent pas de diminuer l’infectiosité des échantillons à des niveaux compatibles avec la sécurité hospitalière.

 

Les procédures de décontamination habituellement préconisées sont :

  • L'autoclavage à 134 / 136 °C pendant 18 min.
  • L’inactivation par la soude 1 N pendant 1h à température ambiante
  • L’inactivation par l'hypochlorite de sodium (2° Cl) pendant 1 heure à 20°C.

 

Le spectre d'inactivation des ATNC est relativement atypique. Les ultrasons les rayonnements ionisants et non ionisants, les nucléases, le formaldéhyde et les détergents sont peu efficaces voir totalement inefficaces. (Latarget et al., 1970) (Gibbs et al., 1978) (Brown et al., 1990) (Taylor, 1996)

Par exemple les ATNC présentent une résistance aux radiations ionisantes 1000 fois supérieure aux plus résistants des agents microbiologiques connus. Par ailleurs, ces agents présentent une forte résistance à l’inactivation par la chaleur sèche.

De manière générale, l'infectiosité résiste bien mieux aux procédés détruisant les acides nucléiques qu'aux procédés dégradants ou dénaturant les protéines; ainsi, les ions chaotropes, le phénol ou les digestions par des protéases diminuent sensiblement le titre infectieux.

 

Résistance et inactivation des ATNC

(Dickinson and Taylor, 1978)

Procédé d’inactivation

Réduction du titre infectieux

Procédés d’inactivation physique

 

Chaleur sèche

Résistance 3 ans à température ambiante

Résistance 24 heures à 160°C

Résistance 1 heure à 360°C

Chaleur humide

Perte de 3,5 à 7,5 logs d’infectiosité à 134°C pendant 20 min. (variable selon les souches)

Ultrasons

Résistance totale

Radiations ionisantes

Dose inactivatrice 37% : >10000 Grays

Rayons ultraviolets

Dose inactivatrice 37% : 40 000 J/m2

Procédés d’inactivation chimique

 

Nucléase

Résistance  quasi-totale

Proteinase K

Résistance partielle

Permanganate de Potassium

Résistance  quasi-totale

Formaldéhyde, Glutaraldéhyde

Résistance  quasi-totale

Bétapropionolactone

Résistance  quasi-totale

Peroxyde d’hydrogène

Résistance  quasi-totale

Ionophores

Résistance  quasi-totale

Acide peracétique

Résistance  quasi-totale

Oxyde d’éthylène

Résistance  quasi-totale

Sodium dodécyl sulfate + chauffage 100°C

Diminution importante de 4 à 10 logs en 1h (variable selon les souches)

Urée 6 M ou 8 M

Diminution de 3 logs

Hypochlorite de sodium 2%

Diminution de 4 à 10 logs en 1 h (selon les souches)

Hydroxyde de sodium 1 M

Diminution de 3 à 6 logs en 1 h  (selon les souches)

 

Purification de l’infectiosité

Malgré des titres infectieux élevés, aucune structure compatible avec une particule virale conventionnelle ou un acide nucléique spécifique n’a pu être mis en évidence dans le système nerveux central quelle que soit la technique utilisée.

Ceci a motivé la mise au point de procédés spécifiques de purification de l’agent transmissible. Ces protocoles associent une protéolyse limitée et des étapes successives d’extraction par des détergents, de centrifugations différentielles et de sédimentation sur gradient de sucrose. Ils ont permis d’isolé une protéine hydrophobe de 27 à 30 kDa, insoluble dans les détergents et résistante partiellement à la digestion par les protéases.

Cette protéine a été appelée PrP pour « Protease Resistant Protein ».(Prusiner et al., 1982) La PrP 27-30 co-purifie avec l’infectiosité et, est le seul composant retrouvé de façon reproductible dans les fractions infectieuses.(Bolton et al., 1982) Sa concentration est proportionnelle au titre infectieux.

En microscopie électronique, elle apparaît sous la forme de structures fibrillaires caractéristiques (SAF pour « scrapie associated fibrills » ou « prion rods »).(Merz et al., 1983; Prusiner et al., 1983) Des travaux ultérieurs ont permis de montrer que la PrP 27-30 également, appelée PrPsc ou PrPres, correspond à la forme anormale d’une protéine constitutive de 33 à 35 kDa codée par l'hôte : la PrPc.

 

PrPres purifiée observée en microscopie électronique

(Merz et al., 1983; Prusiner et al., 1983)

SAF
Prion rods

 

La PrPsc, un analogue pathologique de la PrPc haut

La PrP sous sa forme pathologique présente certaines caractéristiques qui la distinguent de la PrPc.

 

Propriétés comparées de la PrP cellulaire et de la PrPsc

 

 

PrPc

PrPsc

Résistance PK

Nulle

Partielle

Solubilité dans les détergents

Bonne

Faible ou nulle

Digestion PIPLC

Relarguage de la PrP

Inefficace

Structure II

 

 

Hélice

42%

30%

Feuillet ß

3%

43%

Structure III

 

 

Hélice

4 théoriques / 3 déterminés par RMN

2

Feuillet ß

2

4

Temps de demi-synthèse

<1h

15h

Temps de demi-vie

3-6h

>24h

 

 

Structure primaire

La séquence de la PrPsc obtenue par microséquençage partiel de la partie N-terminale et centrale, montre qu’il n’existe pas de différence de structure primaire entre la PrP cellulaire et la PrPsc.(Hope et al., 1986; Turk et al., 1988) La digestion par la protéinase K utilisée lors de la purification de la protéine conduit à l'élimination de la portion N-terminale de la PrP générant une forme de 27 à 30 kDa. Comme la PrPc, la PrPsc possède une ancre GPI à son extrémité C-terminale, et son profil de glycosylation est identique à celui de la PrPc.(Haraguchi et al., 1989)

Structure secondaire

L'analyse de la structure secondaire de la PrPsc, bien qu’étant incomplète, a révélé d'importantes différences avec celle de la PrP cellulaire. L'analyse spectroscopique par transformée de Fourier et dichroïsme circulaire a révélé que la PrPsc contenait 30 % d'hélices et 45 % de structures ß plissées (la PrPc est composée de 40 % d'hélice et environ 3 % de feuillets ß) : l'essentiel des modifications distinguant la PrPsc de son analogue cellulaire, est donc de nature physico-chimique, la PrPsc étant majoritairement constituée de feuillets ß.(Bazan et al., 1987; Nguyen et al., 1995)

Structure tertiaire

A ce jour, en raison des propriétés physico-chimiques de la PrPsc (agrégabilité, insolubilité dans les détergents), aucune structure tertiaire n'a été obtenue par RMN ou par diffraction des rayons X. Les seules structures disponibles ont été établies par modélisation moléculaire (dynamique) à partir des données de FTIR et de dichroïsme circulaire. Selon ces modèles, la PrPsc est composée de 2 hélices et de 4 feuillets ß (Huang et al., 1996). Plus récemment, Wille et al. dans une étude de structure de la PrPsc utilisant la cristallographie par diffraction au rayon X propose la formation d’une hélice ß lors du processus de conversion. (Wille et al., 2002)

Modèle 3D de la PrPsc selon Wille et al. (Wille et al., 2002)

Dans ce modèle, les structures ß sont parallèles et forment une hélice.

                       

            

 

L'hypothèse du prion haut

L’hypothèse de la nature exclusivement protéique des ATNC a été émise dès 1967 et en 1970 sur la base des propriétés physico-chimiques exceptionnelles de ces agents.(Alper et al., 1967; Latarget et al., 1970) En 1982, Stanley Prusiner propose l’hypothèse d’un agent protéique dénué d’acide nucléique et constitué exclusivement de protéines (prion pour proteinaceaous infectious particule).(Prusiner, 1982) L’agent serait la PrPsc elle même, et sa réplication reposerait sur un mécanisme de conversion protéique : la PrPsc pourrait lier la PrPc et la transconformer en PrPsc.

Plusieurs modèles de conversion de la PrPc en PrPsc ont été proposés, notamment :

  • Le modèle de nucléation polymérisation : la transconformation de la PrPc en PrPsc monomérique serait réversible, la PrPsc étant moins stable que la PrPc. L’agrégation de la PrPsc permet sa stabilisation. Des molécules de PrPc pourraient se lier au noyau de PrPsc et y être converties en PrPsc de façon stable et non réversible.(Horwich and Weissman, 1997; Jarrett and Lansbury, 1993; Weissmann, 1996) Dans ce modèle, quand l’agrégat de PrPsc atteint une masse critique, il se dissocie en plusieurs fractions qui à leur tour pourraient reproduire la réaction (amplification).
  • Le modèle de polymérisation assisté par une amorce : dans ce modèle, la PrPsc serait plus stable que la PrPc mais cinétiquement inaccessible ; la conversion passerait par un intermédiaire conformationnel équidistant thermodynamiquement de la PrPc et de la PrPsc. .(Horwich and Weissman, 1997; Prusiner, 1991; Weissmann, 1996) La liaison entre la PrPsc et cet intermédiaire favoriserait sa conversion en PrPsc.

 

Références haut

Alper T, Cramp WA, Haig DA, Clarke MC. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid? Nature 1967; 214: 764-766.

Bazan JF, Fletterick RJ, McKinley MP, Prusiner SB. Predicted secondary structure and membrane topology of the scrapie prion protein. Protein Eng 1987; 1: 125-135.

Bolton DC, McKinley MP, Prusiner SB. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science 1982; 218: 1309-1311.

Brown P, Wolff A, Liberski PP, Gajdusek DC. Resistance of  scrapie  infectivity to steam autoclaving  after formaldehyde fixation, and limited survival after ashing at 360°C: practical and theoretical implications. J Infect Dis 1990; 161: 467-472.

Dickinson AG, Taylor DM. Resistance of scrapie to decontamination. New Eng J Med 1978; 299: 1413-1414.

Gibbs CJ, Gajdusek DC, Latarjet R. Unusual resistance to ionizing radiation of the viruses of kuru, Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75: 6268-6270.

Haraguchi T, Fisher S, Olofsson S, Endo T, Groth D, Tarentino A, et al. Asparagine-linked glycosylation of the scrapie and cellular prion proteins. Arch Biochem Biophys 1989; 274: 1-13.

Hope J, Morton LJD, Farquhar CF, Multhaup G, Beyreuther K, Kimberlin RH. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein. EMBO J 1986; 5: 2591-2597.

Horwich AL, Weissman JS. Deadly conformations - Protein misfolding in prion disease. Cell 1997; 89: 499-510.

Huang ZW, Prusiner SB, Cohen FE. Scrapie prions: A three-dimensional model of an infectious fragment. Fold Des 1996; 1: 13-19.

Jarrett JT, Lansbury PT. Seeding One-Dimensional Crystallization of Amyloid - A Pathogenic Mechanism in Alzheimer's Disease and Scrapie. Cell 1993; 73: 1055-1058.

Latarget R, Muel B, Haig DA, Clarke MC, Alper T. Inactivation  of the scrapie agent by near monochromatic  ultraviolet light. Nature 1970; 227: 1341-1343.

Merz PA, Somerville RA, Wisniewski HM, Manuelidis L, Manuelidis EE. Scrapie-associated fibrils in Creutzfeldt-Jakob disease. Nature 1983; 306: 474-476.

Nguyen JT, Inouye H, Baldwin MA, Fletterick RJ, Cohen FE, Prusiner SB, et al. X-ray diffraction of scrapie prion rods and PrP peptides. J Mol Biol 1995; 252: 412-422.

Prusiner SB. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 1982; 216: 136-144.

Prusiner SB. Molecular biology of prion diseases. Science 1991; 252: 1515-1522.

Prusiner SB, Bolton DC, Groth DF, Bowman KA, Cochran KA, McKinley MP. Further purification and characterization of scrapie prions. Biochemistry 1982; 21: 6942-6950.

Prusiner SB, McKinley MP, Bowman KA, Bolton DC, Bendheim PE, Groth DF, et al. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell 1983; 35: 349-358.

Taylor DM. The resistance of the BSE agent to inactivation. J. Br. Cattle. Vet. Assoc. 1996; 4: 377-379.

Turk E, Teplow DB, Hood LE, Prusiner SB. Purification and properties of the cellular and scrapie hamster prion proteins. Eur J Biochem 1988; 176: 21-30.

Weissmann C. Molecular biology of transmissible spongiform encephalopathies. FEBS Lett 1996; 389: 3-11.

Wille H, Michelitsch MD, Guenebaut V, Supattapone S, Serban A, Cohen FE, et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 3563-8.